PCR反應實驗步驟：

根據PCR使用說明進行試劑混合預配，并設置 PCR 循環。

簡而言之，PCR需要經過以下循環：

1.初始化步驟。這僅對熱啟動 PCR 必不可少。此步驟將溶液加熱至 94-98°C，以激活 DNA 聚合酶。該步驟的時間取決于所使用的聚合酶。

2.變性步驟。DNA是雙鏈分子，DNA擴增需要引物與單鏈DNA模板相互作用。在此步驟中，將反應混合物加熱至 94-98°C 并保持 20-30 秒，以破壞兩條鏈之間的氫鍵并**單鏈 DNA 分子。此時進入 PCR 循環。

3.退火步驟。變性后，反應混合物中的 DNA 模板是單鏈的。由于引物與DNA模板互補，當反應溫度降低到50-65℃時，引物會與模板序列匹配，互補堿基之間形成氫鍵。退火溫度取決于所用引物的Tm，一般比引物Tm低3-5℃左右。該步驟將持續約 20-40 秒以完全退火，然后聚合酶將定位到引物-模板雜交體以開始 DNA 組裝。

4.伸長步驟。在此步驟中，DNA 聚合酶開始合成 DNA，因此溫度應為 DNA 聚合酶的zui適溫度。一般選擇 72°C，但有些酶在 68°C 時效果更好。這一步與體內DNA復制非常相似，DNA聚合酶將dNTPs添加到引物中，以5'到3'方向與模板互補，zui終產生新的雙鏈DNA片段。延伸時間取決于目標 DNA 片段的長度和 DNA 聚合酶的能力。一般來說，DNA 聚合酶每 60 秒產生一千個堿基。

5. 2~4步稱為一個循環，每循環一次，目標片段量翻倍。一個 PCR 過程使用 30-35 個循環。在 PCR 循環的早期，PCR 產物以指數速率積累，而在 PCR 循環的后期，隨著 dNTPs、引物的減少和 DNA 聚合酶在變性溫度下的失活，反應減慢，PCR 速率逐漸下降。

6.zui終伸長率。30-35個循環結束后，在68-74℃的溫度下zui終延伸約5-10分鐘，以充分延伸剩余的單鏈DNA。

7.貯存。zui終產品可以在 PCR 機器中維持溫度在 4-10°C。